应用免疫荧光技术研究水稻条纹病毒(RSV)侵染介体灰飞虱卵巢的过程

由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病,在许多水稻种植区引起严重的减产,水稻条纹病毒由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以持久增殖型传播,并可以经卵传播方式以较高的比例传给子代灰飞虱。为研究水稻条纹病毒的经卵传播特性及其侵染介体昆虫卵巢的过程,分别利用RT-PCR和免疫荧光技术检测虫体各个器官以及卵巢的带毒率,结果表明,饲毒后尽管灰飞虱的带毒率有28.6%,但是仅有5.3%的卵巢被病毒侵染。同时在利用免疫荧光技术对饲毒后不同时间灰飞虱卵巢中的RSV进行定位,发现RSV首先在卵巢管柄位置出现,随后侵染滤室细胞及生殖区,最后转移到胚盘细胞。结果认为,病毒可能是在滤泡细胞以及生殖区向正在发育的卵母细胞提供营养时,伴随这些营养物质进入卵母细胞。且生殖区的卵原细胞可发育成卵母细胞和滤泡细胞,我们推测,尽管RSV可伴随营养输送进入卵母细胞,但是最初带毒卵母细胞的病毒可能来源于位于卵巢生殖区的病毒。研究结果提示,RSV可能通过营养输送途径运送至卵母细胞,并最终侵染卵的胚盘细胞     

稻瘟菌基因组规模分泌蛋白的预测分析*

 利用信号肽分析软件SignalP v3.0,亚细胞器蛋白定位软件TargetP v1.01,GPI-锚定位点软件big-PI Predictor和跨膜螺旋结构软件THMM-2.0这4个软件分析预测稻瘟菌12595个蛋白序列中有1134个分泌蛋白。编码这些蛋白的可读框(ORF)最小值为78bp,最大值为7849bp,平均1231bp。引导它们的信号肽长度介于15～45个氨基酸之间,平均为21个氨基酸。435个分泌蛋白具有功能描述,主要是与代谢有关的酶类。分析了其中降解细胞壁组分和与致病相关的酶类,提示在稻瘟菌侵染水稻不同阶段产生的关键酶及基因的功能需进一步研究。     

水稻悬浮细胞培养过程中3个逆转座子的转录与转座特性

【目的】在水稻悬浮细胞培养不同时期研究3个具有多逆境应答特征逆转座子相关基因的转录与转座特性,为揭示该类基因的生物学功能奠定理论基础。【方法】以水稻品种月亮谷为材料进行悬浮细胞培养,以实时荧光定量PCR检测不同培养时期材料的3个逆转座子相关基因Tos17、Os05g24920和Os01g02040相对表达量及拷贝数的变化,初步分析其转录活性与转座活性。【结果】在培养期间,Os01g02040、Os05g24920、Tos17转录活性呈先升高后下降的变化趋势,其最高转录活性分别出现在培养期的第3个月和第6个月,相对表达量分别为71.84、41.26和53.20倍;Tos17保持较稳定的转录活性,其他2个基因在组培6个月后转录活性迅速下降。在培养3个月后,Os01g02040和Os05g24920的转座活性变化较稳定,相对拷贝数变化范围为2.14-2.64和2.76-5.03倍;Tos17转座活性变化极明显,拷贝数不断提高,至第14个月达12.13倍,明显高于其他两个基因。【结论】在细胞悬浮培养过程中3个逆转座子相关基因均被强烈激活进行转录,但其转录调控和转座调控途径不同。     

烟草疫霉的快速分子检测

 根据烟草疫霉与其他疫霉菌ITS序列的差异设计了1对寡聚核苷酸引物,用于烟草疫霉的PCR检测。结果表明,在优化的反应体系与扩增条件下,该对引物表现出强特异性,只在烟草疫霉为模板的扩增体系中具有1条660bp的条带。利用此特异性引物可稳定地从含有烟草疫霉的土壤及其发病组织中检测出病原菌。本实验提供并完善了一套快速检测烟草疫霉的方法和技术,特别对土传病害的准确诊断与快速检测在实践和理论上具有重要意义。     

云南烟草赤星病菌及近似种rDNA ITS序列分析

 为了进一步研究云南省烟草赤星病病原的系统发育关系,提取28份供试菌株的菌丝基因组DNA,进行rDNA ITS序列及两侧ITS序列扩增。28个供试菌株与GenBank中登录的链格孢属7个种（包括5个小孢子种Alternaria citri,A．alternata,A．longipes,A．mali,A．gaisen和2个大孢子种A．porri,A．solani）14个菌株的序列进行聚类分析：42个菌株明显地分成两支,供试菌株与5个小孢子种聚为一个分支,序列同源性高达99％～100％,没有明显的地域性差异;但另2个大孢子种聚为单独的一支,明显地与供试菌株和其他5个小孢子种区分开。rDNA ITSl 58S ITS2序列在相对保守的基础上又存在一定变异,在一些菌物属的研究中可作为分类鉴定、分子标记、系统发育的重要依据,但通过对世界各地Alternaria菌株序列的分析发现,rDNA ITS1 58S ITS2仅能将大孢子种和小孢子种分开,还不能作为区分不同地域不同来源菌株的标准。     

烟草扭脉病毒部分基因组特征及其分类地位分析

通过RT-PCR从烟草丛顶病发病烟株总RNA中获得烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）基因组部分序列。序列分析显示该片段全长1655bp,共包含TVDV的部分RdRp基因、完整的CP基因和完整的MP基因。其中RdRp基因与CP基因的间隔区（IR）长201nts,符合马铃薯卷叶病毒属病毒的归属依据;对RdRp、CP、MP基因以及IR序列的对比分析,显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的较高同源性。根据三个ORF编码的氨基酸序列构建的分子同源树的分析,也都显示了TVDV与黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属病毒的同源性最高,进一步证实了TVDV应该是黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的确定成员。     

烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用

为制备烟草丛顶病毒(TBTV)ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物(TBTV-BSLLi)的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a(+)中,通过热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(plysS),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白.用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清.DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草(Nicotiana tabacumL.)样品及传播介体的检测.本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件.     

新蚜虫疠霉菌株KM0107的产孢量及其对不同蚜虫的毒力

采用孢子浴法测定了新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis)KM0107菌株在RH85%、光周期L:D=12:12、不同温度(15、18、21、25、28℃)条件下的产孢量及其对桃蚜(Myzus persicae)、萝卜蚜[Lipaphis erysimi(Kaltenbach)]、麦长管蚜[Sitobion avenae(Fabrici-us)]、豌豆长管蚜(Macrosiphum pisi)和玉米蚜[Rhopalosiphum maidis(Fitch)]的毒力。结果表明,在28℃条件下菌株KM0107的产孢量最高,培养30 min时产孢量为99.60±4.04孢子。该菌株对桃蚜、萝卜蚜、麦长管蚜、豌豆长管蚜和玉米蚜均具有一定的毒力,在高剂量82.42孢子/mm2的接种剂量下,麦长管蚜、豌豆长管蚜、萝卜蚜、桃蚜和玉米蚜的累积死亡率分别为(92.75±3.54)%、(73.33±4.32)%、(93.75±4.53)%、(98.21±5.46)%、(92.00±5.63)%;致死中分别为(2.3±0.42)、(3.2±0.35)、(2.7±0.35)、(2.6±0.32)、(3.5±0.25)d;接种处理后第7 d致死中量分别为1.61、1.72、1.63、1.53、1.59孢子/mm2。     

柿叶总黄酮和总多糖的提取工艺研究

采用单因素试验和正交试验设计,探讨提取时间、料液比、提取溶剂和提取次数对柿叶总黄酮和总多糖提取率的影响,筛选出了最佳提取工艺.正交试验结果表明,柿叶总黄酮提取的最佳工艺为:60％乙醇回流提取2h,提取2次,料液比为1 g:30 mL;总多糖提取的最佳工艺为:60％乙醇回流提取1h,提取1次,料液比为1 g∶20mL.本研究为节省提取工艺成本、降低能耗和工业化生产的合理化提供了科学依据,并为柿叶多糖和黄酮类化合物的开发应用研究奠定了理论基础.     

滇重楼内生真菌的分离及其抗菌活性分析

为了解滇重楼内生菌的多样性及其抗菌能力,采用切块法分离内生菌,采用形态学观察法初步鉴定内生真菌,采用对峙试验法分析内生菌的抗菌活性。结果表明:从滇重楼植物中分离到98株内生真菌,经微生物学形态观察,初步鉴定归属于4个目,6个科和12个属。分别是根霉属(Rhizopus)、镰孢菌属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、束丝菌属(Ozonium)、组丝核菌属(Sclerotium)、青霉属(Penicillium)、头孢霉属(Cephalosporium)、梳霉属(Kickxella)、筒孢霉属(Cylindrium)、刚毛孢属(Pleiochaete)、小单头孢霉属(Acremoniella)及孔球孢属(Gilmaniella)。对植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有抑菌效果的共有8株,其中PPC-78和PPC-43对供试病原菌的抑菌效果最强,PPC-43对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌菌丝生长的抑菌率分别为88.76%、93.67%和82.31%,而PPC-78的抑制率分别是93.55%、100.00%和95.88%。